范可尼贫血研究进展


范可尼贫血(Fanconi anemia,FA)是一种常染色体隐性遗传性疾病,其发病率为(1~3)/107,基因携带频率为1/300。本病在各种人种中均有发现,在某些人群中发病率异常高(目前已发现在Ashkenazi犹太人、南非人、某些土耳其和沙特阿拉伯人群中发病率较高),其病态基因携带率为1/100[1-3],近亲婚配者发病概率增加。
1 诊断

  FA典型的表现为造血功能衰竭;多发性先天畸形,如发育迟缓、矮小、拇指畸形、桡骨畸形、心肾畸形等。FA的全血细胞减少多出现在5~10岁。若发生造血功能衰竭,易发展为白血病或骨髓增生异常综合征,Butturini等[4]分析了388例FA患者,发现59例发展为骨髓增生异常综合征或急性非淋巴细胞白血病,预计如果FA患者能活到40岁,其发展为上述两种疾病的概率为50%。患者还易患其它恶性肿瘤。
  Auerbach等[5]分析222例FA,发现44%的患者表现为造血异常和先天畸形,51%的患者仅有造血异常或先天畸形,5%的患者两者全无。它既可与一些遗传性疾病,如Vater综合征、Holt-Oram综合征、Diamond-Blackfan综合征相似,又可与一些非遗传性疾病,如再生障碍性贫血、急性非淋巴细胞白血病和骨髓增生异常综合征的临床表现类似[5]。因此,仅靠临床表现难以诊断FA。所幸的是FA细胞对某些DNA交链因子,即丝裂霉素(mitomycin C,MMC)/二环氧丁烷(diepoxybutane,DEB)异常敏感,在低浓度的MMC/DEB诱导下FA患者的染色体断裂率明显高于正常人。利用这一特征,可将FA与其它疾病分开。有关专家一致认为FA的诊断要靠MMC/DEB诱导的染色体畸变试验,而且此实验已广泛应用于从再生障碍性贫血、急性非淋巴细胞白血病、骨髓增生异常综合征、以及FA患者的兄弟姊妹中排除FA[5]。

2 遗传异质性与互补群

  利用体细胞融合杂交技术和FA细胞对交链因子异常敏感的缺陷研究FA的遗传异质性,称互补分析(complementation analysis)。即用EB病毒活化FA患者的B淋巴母细胞,建立传代细胞系,这样的FA B淋巴母细胞系仍具有FA细胞的缺陷,即对交链因子敏感。将来源于不同FA患者的细胞系融合杂交,检查子代杂交细胞的FA样缺陷,如果子代杂交细胞这一缺陷得到纠正,称为互补(complementation),表示其父代的两株FA细胞存在不同的基因缺陷,属于不同互补群(complementation group);如果子代杂交细胞这一缺陷得不到纠正,称为不互补(non-complementation),表示其父代的两株FA细胞存在同一基因的缺陷,属于同一互补群。Joenje等[6,7]借此法,至今已发现FA至少有8个互补群(A,B,C,D,E,F,G,H)。
  已有的资料表明,不同互补群在FA人群中的比例不同,FANCA占66.0%,FANCC占12.7%,FAB占4.3%,FAD占4.3%,FAE~FAH占12.7%。不同人群的互补群分布不同,在Ashkenazi犹太人以及荷兰人中FANCC较多;在意大利人和南非讲Afrikaans语的人群中FANCA较多;而德国人中FA各个互补群均有发现,且无优势互补群;至今尚无亚洲人群互补群的资料[7,8]。
  在FA中不同互补群可能代表不同的基因[9]。FANCA,FANCC和FANCG基因已克隆,FAD已定位于3p22~26的区域[10]。
  互补群的分析有以下意义:可通过互补群在人群中的分布估计FA不同基因在人群中的分布;互补群分析法为克隆不同的基因提供了基础;经互补群分析,如患者为FANCA,FANCC和FANCG,则可进一步进行突变分析,了解患者的分子缺陷,为基因治疗提供依据。因此,本研究领域的多数专家建议对FA的诊断还应包括互补群的分析。不同互补群与患者的临床表现无明显关系。
  下面仅对基因已被克隆了的三个互补群(FANCC,FANCA和FANCG)的分子水平的研究进展略述如下:
2.1 FANCC基因,突变,及分子缺陷与临床的关系:
  Strathdee等[11]利用cDNA表达克隆法克隆了FANCC基因。他们用含人淋巴母细胞cDNA文库的游离型载体pREP4转染HSC536(FA-C)细胞系,经MMC/DEB筛选出8个阳性克隆,从这8个阳性克隆中分离出的 8个cDNA均有同样的开放阅读框架(open reading frame),而5′UTR和3′UTR不同。FANCC cDNA的长度约为2.3kb,FANCC基因位于染色体9q22.3,长1674bp,含14个外显子,大小为53bp~204bp,编码一个558个氨基酸的蛋白质[11,12]。分析FANCC患者的基因,发现存在各种不同突变,例如框移突变、剪接点突变、错义突变、终止突变等,且分布于不同的DNA区域[5,12-14]。
  FANCC标准参照细胞系HSC536来源于1例杂合子患者,其两条等位基因的突变不同,分别为L554P(引起FANCC蛋白失活)和327bp缺失(引起FANCC蛋白不能合成)。
  Auerbach等[5]分析FANCC基因型与表现型的关系,发现基因缺陷与临床表现有一定关系,并将FANCC分为3组:IVS4突变;外显子14至少含一个突变,如R548X或L554P;外显子1至少含一个突变,如322delG或Q13X,无外显子14的突变。IVS4突变或外显子14突变的患者造血系统异常发生早,发展为急性髓系白血病(AML)早,平均年龄分别为10.8岁和15.9岁,预后差;而外显子1突变组发展为AML平均年龄为21.9岁。
2.2 FANCA基因,突变,及分子缺陷与临床的关系:
  继克隆出FANCC后,Ten Foe等[15]用同样的方法克隆出FANCA cDNA,同时另一组研究者用定位克隆法和家系分析也克隆出FANCA cDNA。其长度为5.4kb,开放阅读框架为4348bp,1.1kb的3′UTR,31-nt的5′UTR。FANCA基因定位于染色体16q24.3的区域,长度超过80kb,有43个外显子组成,外显子含34bp~188bp ,编码一个1455个氨基酸的蛋白质[16-18]。
  分析欧洲97例FANCA患者,发现在基因的各个区域均有突变,28例患者中有27种突变,他们包括框移突变、终止突变、剪切点突变、错义突变和大片段缺失突变,其中最多的突变是1263delF,5个无亲缘关系的患者均为此突变。另有13个错义突变,因在1名正常人中查出,尚无法肯定是病理突变还是基因的多态性[18,19]。
  FANCA分子缺陷与临床表现的关系尚不清楚。
2.3 FANCG基因,突变,及分子缺陷与临床的关系:
  Winter等[19]用表达克隆法再次成功地克隆了FANCG基因,FANCG cDNA长约2.5kb,其中含1869bp的开放阅读框架,编码相对分子质量约70×103的蛋白质。FANCG 基因与人XRCC9基因有着相同的开放阅读框架和3′UTR序列。而XRCC9基因具有逆转MMC敏感的中国仓鼠细胞系UV40细胞对MMC的敏感的缺陷的功能,XRCC9可能参与DNA复制后的修复或细胞周期调控。分析4例FANCG患者,发现2种突变:终止突变和错义突变。由于FANCG病例太少,尚无法分析其基因缺陷和临床表现的关系。

3 血液系统嵌合体现象

  在有些FA患者的外周血中同时存在两群细胞,一群对MMC等交链因子敏感,为FA样细胞,另一群对MMC等交链因子不敏感,表现为“正常”细胞,这种现象称为嵌合体(mosaicism)。从这样的患者建立的B淋巴细胞系常为MMC耐药株,而其成纤维细胞系仍对MMC敏感。最近,Ten Foe等[20]研究1例女性FANCC嵌合体患者的耐MMC 的B淋巴细胞系,探讨其嵌合体形成的机制。该患者为杂合子,两条等位基因分别含有两个不同的框移突变:322delG(外显子1)和1806insA(外显子14)。研究发现在有丝分裂中,染色体互换重组,重组部位位于两个突变之间的染色体区域,结果使两个突变位于同一条等位基因上,而另一条等位基因恢复正常,产生了耐MMC的逆转细胞。嵌合体现象的临床意义尚不清楚。分析此类患者,发现有些嵌合体患者无血液系统异常或血液系统异常很轻,少数嵌合体患者随年龄的增长,其正常细胞比例增加,FA样细胞减少,相应的临床血液系统异常也逐渐减轻,甚至缓解。因此推测,逆转细胞有生长优势,如果逆转细胞为造血干细胞,可正常造血,将改善患者的血液学异常,这也许是基因治疗的天然模型。然而,也有一些嵌合体患者仍发展成严重的血液病。

4 FA的治疗

  FA可用雄性激素、肾上腺皮质激素、造血细胞生长因子治疗,但疗效难以持续,而且只是改善症状,不能治愈。
4.1 骨髓移植:骨髓移植至今仍是治愈FA的唯一手段,然而常规的骨髓移植前预处理对FA患者来讲,毒性太大,死亡率极高。Gluckman等[21]用以下修改方案:环磷酰胺 20mg.kg-1.d-1,共4天,5Gy胸腹放射,并采用环孢霉素A预防移植物抗宿主病(GVHD),对45例FA患者进行预处理,然后分别采用HLA完全匹配的同基因骨髓移植,5年存活率达75%;对47例HLA完全匹配的患者行同种异基因骨髓移植,除用上述预处理方案外,还对其中10例患者进行了供体骨髓去T细胞,受体加用抗胸腺细胞球蛋白(ATG)或单抗预防GVHD,18例改用全身照射,2年存活率达30%。分析各种因素对FA同种异基因移植疗效的影响,发现去T细胞、照射方式和从发病到移植的时间可能对预后影响最大。总之,他们认为低剂量的预处理方案明显改善了同基因骨髓移植的疗效;全身照射和去除T细胞明显改善了同种异基因骨髓移植的疗效。
4.2 脐血移植:Gluckman等总结了欧洲的16例脐血移植的FA病例,其中8例为相关供体脐血移植,5例仍存活;8例为无关供体脐血移植,1例仍存活。脐血移植结合基因治疗可能是治疗FA的新途径。
4.3 基因治疗:FANCC基因的克隆使基因治疗成为缺乏适当供体的FANCC患者的选择。Liu等在体外用逆转录病毒载体将正常的FANCC基因转导入FANCC患者的造血干/祖细胞中,可纠正FANCC患者的造血干/祖细胞对MMC的敏感,而且纠正了的FANCC造血细胞具有生长和扩增优势;Joenje等研究嵌合体时也发现部分嵌合体患者血液系统异常较轻,提示逆转的FA造血细胞具有生长优势。依据以上结果,提出假设:将体外导入正常FANCC基因的患者的造血干细胞回输给患者,虽然这种纠正了的造血细胞不多,但由于其具有生长优势,可能可以逐步替代有缺陷的FA造血细胞,控制患者的造血系统,使其造血恢复。据此,Walsh等[22]对1例FANCC患儿进行了基因治疗的Ⅰ期临床研究,他们采集患者的外周血白细胞,用免疫磁珠法富集CD34+细胞,在体外用逆转录病毒载体导入正常的FANCC基因,然后将这些CD34+细胞回输给患者,这一治疗每3个月1次,共1年。在最初的观察中发现,治疗后患者骨髓和外周血中均可查到纠正的CD34+细胞,骨髓细胞学及临床症状也有改善,而且无论有无MMC存在,患者CFU-GM,CFU-E等数量均增加。该治疗最后的疗效评价尚待公布。
  Fu等[23]也进行了FANCA基因治疗的基础研究。分别将4.3kb和5.5kb的FANCA cDNA克隆于PG1逆转录病毒载体中,然后转导FANCA的CD34+细胞,发现转导后的CD34+细胞集落形成率高于对照组,集落也大于对照组,而且在低浓度的MMC存在下,转导后的CD34+细胞可形成集落,而对照组的CD34+细胞则不能。目前,对FANCA基因治疗的临床研究尚待开展。

作者单位:谢燕 陈济民 430060 武汉,湖北医科大学附属第一医院血液科

参考文献

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