范可尼贫血的实验室诊断和治疗进展


范可尼贫血( Fanconi anemia,FA)是一种常染色体或X连锁隐性遗传性疾病,以造血衰竭为主要临床表现,常易并发各种躯体畸形及早发多种实体肿瘤,主要通过临床表现及相关实验室检查进行诊断。

FA的临床诊断主要依据完整的病史、临床表现和相应的实验室检查,其中完整的病史包括患者的个人病史与其完整的家族史,当近亲及家族其他成员出现贫血、血小板减少、肢体发育异常、乳腺癌、头颈部肿瘤等均有助于诊断此病。

FA的临床表现除主要的血液学异常外,还表现为躯体畸形、内分泌疾病、听力下降、不孕不育及发生实体肿瘤等临床表现。随着人们对于FA分子机制认识的不断深化,FA诊断与治疗手段也有了很大的进展。现就FA的实验室诊断与治疗的进展作一综述。

一、FA的实验室诊断进展

1.染色体断裂试验:将FA患者的细胞暴露于双环氧丁烷( diepoxybutane,DEB)和丝裂霉素C(mitomycin C,MMC)等DNA交联剂中,以出现大量的染色体异常,尤其是染色体断裂和环状染色体形成为阳性结果。DEB诱导的染色体断裂试验已广泛用于FA的初筛。

由于实体中存在嵌合现象(即同时存在2个或更多的基因型细胞),所以测定异常细胞的数量比仅检测单个细胞的染色体异常更有价值。当然,染色体断裂试验也会出现假阳性,比如奈梅亨断裂综合征和罗伯茨综合征患者的细胞暴露于DNA交联剂后也会发生染色体畸变。尽管如此,此方法仍是FA初筛的常用方法。

2.外周血细胞周期检测:无论在DNA交联剂处理前后,FA患者细胞大多阻滞于细胞周期的G2/M期(4倍体),此点对于FA的诊断具有一定意义,但当FA患者伴有骨髓增生异常综合征( myelodysplastic syndromes,MDS)或急性髓系白血病( acute myelocytic leukemia,AML)时,流式细胞检测结果则容易出现假阴性结果。对于此类患者可以通过检测体外培养的皮肤成纤维细胞进行鉴别诊断,但此项检测目前临床应用较少,多用于科研方面的研究。

3.互补实验:将患儿的FA细胞感染携带有不同FA亚型的cDNAs反转录病毒,转导带有合适的FA互补群( FANC)cDNA后,即可纠正FA细胞如染色体断裂和对DNA交联剂高敏感的现象,但这种方法需要克隆不同的FA亚型基因,而且仅限于某些有条件的研究室进行,所以临床使用受到很大限制。

另外,由于该方法需要知道已知亚型的基因,故对于在临床上由未发现的突变基因所致的FA患者极易出现漏诊。目前在国内这类互补实验尚未开展,国外也主要用于临床科学研究中。

4.测序分析:近年来基因检测也已用于FA的诊断及分型,这种方法不仅可以发现新的突变基因,而且所检测出的杂合突变基因对FA患者或FA基因携带者具有一定的临床意义。FA途径异常是FA发病的主要分子机制,已发现16种已知致病基因(FANCA、B、C、D1、D2、E、F、G、I、J、L、M、N、O、P与Q),存在16种相应的FA疾病类型。

目前临床主要以互补实验和突变分析确定FA患者的亚型,通常的分析策略是按FA发病率对基因进行排查,常见的检测指标有FANCA、FANCB、FANCC、FANCE、FANCG及FANCD2。如果患者找到了突变,则定为相应类型,如若没有就进一步再筛查。但有趣的是,即使是同样亚型的FA患者其临床表现和预后也有差异,而且单个基因突变也不能解释FA患者的临床表型。

研究发现,FANCC、BLM、BRCA2突变的FA患者乳腺癌发生风险明显增高;FANCD2杂合突变者更容易发生T淋巴细胞白血病和精原细胞瘤。因此,FA患者临床表现的异质性可能与患者不同的突变类型及携带的突变基因有关。我们课题组通过研究也发现不同FA突变基因携带者的临床表现和对治疗的反应可能存在一定的关系。

近年来,人们利用基因测序技术检测相关基因突变以进行临床诊断,但选择测序基因大多是通过临床表现推测患者为某种疾病后制定的,很可能出现漏诊的情况。另外,目前临床多采用一代测序技术,其费用昂贵,很难广泛推广应用。人们利用第二代高通量测序技术,结合微阵列技术而衍生出来的目标序列捕获测序技术,可能为临床提供了较快速、准确、廉价的诊断方法。

由于某些突变尚未经过确定是否与发病有关,或尚未在相关数据库中出现,结果不能得到科学合理的解释,故需要继续通过临床样品收集与基础实验研究来发现更多的突变基因,为FA基因数据库中提供更加全面的数据,服务于今后的FA诊断。

5.Western方法检测FANCD2蛋白的泛素化:FANCD2蛋白在K561位点赖氨酸的单泛素化修饰是FA途径发挥作用的关键环节。通过Western方法检测FANCD2蛋白是否发生泛素化可以用于FA的诊断。值得注意的是,FANCD2蛋白的泛素化主要受到上游相关FA蛋白的影响,所以如果突变基因发生在FANCD2下游,则容易出现漏诊的情况。

与基因测序相结合可以对FA做出较全面的诊断,尤其是临床表现不典型但又怀疑为FA的患者。目前国内此项检测多用于实验研究,一些公司也开始进行这项检查,但由于费用昂贵在临床上还没有得到推广。

人们对于FA途径蛋白复合物的研究越来越深入,不断有新的与FA途径或FA疾病相关的蛋白被发现,并从泛素化、磷酸化等角度研究这些蛋白在细胞周期、DNA损伤、肿瘤发生等FA途径相关生物学事件中的分子调控机制。通过实验发现更有效的介导FA发生的分子靶点,将会为FA患者提供更加直接和准确的诊断方法。

二、FA患者的治疗进展

1.骨髓衰竭的治疗:骨髓衰竭是FA患者最具特点的临床表现。雄激素对部分FA患者的骨髓衰竭具有一定作用。人工合成雄激素,如羟甲烯龙和达那唑,对FA患者的造血功能缺陷发挥一定疗效,但应考虑长期使用雄激素所引起的多种不良反应(如多毛症和肝肿瘤发生等)。造血干细胞移植( hematopoietic stem cell transplantation,HCT)是FA患者骨髓衰竭最主要的治疗方法。

因为FA患者DNA修复缺陷,过多的放疗与化疗会产生较大的毒副作用,因此尽早实行组织相容性同胞供者移植是最佳的治疗选择。如果移植前处理方案毒性较大,移植后会发生很多并发症,包括由放化疗所致的物理损伤(包括肺和肾脏毒性以及静脉闭塞性疾病),移植物抗宿主病(graft-versus-host disease,GVHD),免疫损伤,不育症和内分泌疾病等。

较好的HCT前处理方案,如减低剂量的环磷酰胺(烷化剂),基于福达拉滨的诱导强化方案(免疫抑制治疗),或不进行照射,在保证植入成功率的前提下尽量减少这些并发症的发生率。

FA诊疗指南中对骨髓衰竭的治疗提出以下建议,首先根据患者的中性粒细胞计数、血小板计数及血红蛋白含量分为轻、中、重度三型,再根据不同的类型进行治疗选择。比如当中性粒细胞计数<1 000/mm3,血小板计数<50 000/mm3,血红蛋白量<80 g/L时定义为中度骨髓衰竭;在条件允许时可以进行HCT。

2.内分泌异常的治疗:很多FA患者出现甲状腺功能减退的症状。研究发现,以甲状腺制剂治疗身材矮小的FA患者7个月后可以明显改善其生长情况,但对于长期使用生长激素是否能够增加AML和其他癌症的发生风险仍存在争议。对于糖尿病患者,则需通过检查其胰岛素水平等变化并予以相应处理。

3.癌症的处理:对于移植后FA患者,FA相关癌症的有效预防和早期治疗成为新的挑战。由于放疗与化疗对FA患者的毒副性作用较明显,故FA患者相关癌症的治疗策略不同于一般患者。FA患者何时开始预防癌症,何时又应结束是临床管理的重点。

为此,FA患者必须每年进行骨髓检测以排除早期恶性克隆扩增的可能性;经常检查牙龈以排除早期口腔SCC的发生;女性FA患者应经常进行妇科检查以早期发现宫颈部的scc。目前对于是否为所有的FA患者接种HPV疫苗仍有争议。一些FA亚型存在特异的肿瘤类型,例如,FANCDl/BRCA2突变的FA患者早期易发生白血病或实体肿瘤。

4.FA治疗展望:尽管FA的生物学研究有了很大进步,但关于造血干细胞缺陷、发育异常以及骨髓衰竭的机制仍不清楚。研究发现,FA与DNA损伤修复密切相关,FA干细胞DNA修复能力缺陷会使DNA对氧化应激或甲醛损伤等更加敏感。具有抗氧化作用的SIRT1激动剂白藜芦醇可以补偿FANCD2老鼠造血干细胞的缺陷,提示减少内源性DNA损伤物质可能会对FA患者的造血干细胞起到保护作用。

目前治疗FA最好的治疗方法为HCT及相关并发症的对症处理,随着临床经验的积累和科技的发展,HCT方案已得到改进,基因治疗等多种手段也正在研究中。向FA患者移植cDNA-相关的诱导多潜能干细胞(induced pluripotent stem cells.iPSCs)可能成为治疗FA的方法,这种方法可能会克服传统基因治疗的局限性和骨髓移植相关并发症。

当然,这种方法用于临床还存在很多问题,如致癌基因和病毒介导基因的插入可增加肿瘤的形成。从iPSCs成功诱导出血细胞的前体细胞,成为长期的造血干细胞,并用于FA患者的移植将成为一项挑战性工作。尽管如此,iPSCs技术仍为FA患者组织相容性移植提供了新的思路。

总之,随着诊断技术的提高和治疗手段的改进,FA患者的诊断及治疗有了新的变化趋势,但新事物的出现必然具有利弊两面性,只有通过不断的机制研究与科学评价,才能为FA患者提供更加科学合理的治疗方案与措施。

文章摘自《中华儿科杂志》2014年11月第52卷第11期P833-834

文章作者:常丽贤 竺晓凡

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